инженер-химик.рф

Информационный портал для химиков


Разрушение клеток и экстракция белка

Большая часть белков и ферментов, изученных в ранний период развития белковой химии, были внеклеточными. Причина этого в том, что такие белки сравнительно легко выделялись, внеклеточные белки более стабильны (часто имеют в своей структуре дисульфидные мостики), обладают небольшой молекулярной массой. Именно для этих белков первыми были установлены структуры: для лизоцима, рибонуклеазы, химотрипсина.

Однако большинство белков локализовано внутри клеток. Как показала практика, они менее стабильны, часто не содержат дисульфидных связей. 

После того, как выбран источник выделения белка, следующим шагом является экстракция его из ткани. Вначале необходимо разрушить клетки и органеллы, что достигается измельчением в гомогенизаторе с последующей экстракцией буфером.

Животные ткани различаются по своей прочности: легко разрушаются эритроциты, а в кровеносных сосудах, напротив, содержится жесткий коллагеносодержащий материал. Успешным является замораживание ткани в жидком азоте и измельчение ее в замороженном состоянии. Ряд белков можно извлечь из тканей после обработки их ацетоном или другими органическими растворителями. Растительные клетки труднее разрушаются, так как содержат целлюлозную оболочку. Некоторые бактерии легко разрушаются под действием осмотического шока, а более устойчивые с толстой клеточной стенкой требуют механического воздействия, например ультразвуком.

Таким образом, способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы: 1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракция дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор). 2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками). 3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы.

Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Обычно объем раствора в 2-3 раза превышает объем ткани. После экстракции белка массу центрифугируют при 10.000-20.000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Смесь до центрифугирования называют гомогенатом. Жидкая фаза после осаждения нерастворимого материала (надосадочная жидкость или супернатант) носит название «экстракт».

Экстракция белков, связанных с мембраной представляет особую проблему. Иногда выделение таких комплексов удается провести с использованием детергентов, в состав которых входят липофильные (алифатические или ароматические) цепи, взаимодействующие с гидрофобными поверхностями белка и вытесняющие его из комплекса с нормальной мембраной. Из детергентов наиболее широко применяются дезоксихолат, додецилсульфат натрия (анионный детергент), тритон Х-100 и др. Тритон – это торговое название целой серии в большинстве своем неионных детергентов на основе полиэтиленгликоля.

Если экстракция была проведена из микробных или растительных источников или из ядер животных клеток, раствор содержит большие количества нуклеиновых кислот. Для удаления этих полианионов, взаимодействующих с белками, доводят рН раствора до 5 или добавляют такие соединения как протаминсульфат или стрептомицин. Нуклеиновые кислоты могут быть удалены также обработкой РНК-азами и ДНК-азами с последующим удалением низкомолекулярных соединений. После центрифугирования на поверхности экстракта могут плавать частицы жира. Его можно удалить фильтрацией через стекловату или плотную ткань.

Сложности работы с растительными экстрактами состоят в том, что большинство растений содержат фенольные соединения, которые легко окисляются под действием эндогенных фенолоксидаз с образованием темных пигментов. Эти пигменты ковалентно соединяются с белками и инактивируют многие ферменты. Кроме того, они мешают определению количества белка в экстрактах, так как такие классические методы как метод Лоури основаны на реакциях с ароматическими аминокислотами. Известны два способа решения этой проблемы. Во-первых, добавление какого-либо тиолового соединения, например β-меркаптоэтанола, сводящего до минимума действие фенолоксидаз. Во-вторых, добавление порошкообразного поливинилпирролидона, адсорбирующего фенольные соединения.

Если экстракт, содержащий значительную часть исследуемого белка, получен, из него удалены частицы и небелковый материал, можно приступать к очистке белка.

Комментирование закрыто.