инженер-химик.рф

Информационный портал для химиков


Осаждение белков

Реакции осаждения белков.

Белки в р-ре и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового р-ра.

Обратимое осаждение.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание.

Разделение белков на основе их различной растворимости является классическим методом. Так фракционирование солями основывается на избирательном разделении белков вследствие их различной растворимости в растворах солей. Соль подбирается в соответствии со следующими требованиями: она должна обладать достаточной растворимостью, которая не меняется значительно в зависимости от температуры, при добавлении соли не должен заметно меняться рН раствора, она легко отделяется от белка и не оказывает денатурирующего действия. Наиболее часто употребляемой солью для фракционирования белков является сульфат аммония. Обычно проводят фракционное осаждение белков возрастающими концентрациями сульфата аммония. При описании методов выделения количество сульфата аммония выражают в процентах насыщения и часто употребляют выражения вроде «фракция, осажденная между 55 и 60% насыщения». Правильно рассчитать количество соли, которое нужно добавить к данному объему раствора, чтобы получить указанный процент насыщения, не простое дело. Поскольку при растворении соли меняется объем жидкости, количество соли, которое нужно добавить к данному объему жидкости, не пропорционально требуемому проценту насыщения. Обычно пользуются специальной номограммой, с помощью которой можно определить количество соли, необходимое для перехода от одной степени насыщения к другой, или расчетными таблицами.

Высаливание при добавлении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является эффективным способом концентрирования — при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора, приблизительно 85%-ного насыщения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации немногие белки имеют растворимость выше 1 мг/мл. Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1 мг/мл, то перед высаливанием следует повысить ее, например, с помощью ультрафильтрации.

Пример:

Насыщенным р-ом сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным р-ром – глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Реактивы: 1)неразведенный яичный белок; 2) насыщенный р-р сульфата аммония; 3) NaOH, 10% р-р, 4) CuSO4, 1% р-р; 5) дистл-ая вода; 6)сульфат аммония в порошке.

Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразв-го яичного белка и добавляют равное количество насыщенного р-ра сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный р-р сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в р-ре. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится раств-ие соли, при этом выпадает осадок – глобулины.

Осаждение белков органическими растворителями

Это один из старых методов. Он играет важную роль при очистке белков в промышленных масштабах. Чаще всего используют такие растворители как этанол и ацетон, реже – изопропанол, метанол, диоксан. Основной механизм процесса: по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка.

Используемый растворитель должен полностью смешиваться с водой, не реагировать с белками и обладать хорошим осаждающим действием. Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0°С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру. Наиболее часто для осаждения белков используется ацетон. Он обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при минусовой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении.

Методика осаждения состоит в следующем: образец обычно охлаждают до 0° С в ледяной бане со льдом. Концентрация белка может быть 5-30 мг/мл, а концентрация соли не должна быть высокой. Высокая концентрация соли снижает электростатическую агрегацию, и требуются более высокие концентрации растворителя, что увеличивает вероятность денатурации. При низкой концентрации соли может образоваться тонкая взвесь, которую трудно осадить. Оптимальная концентрация соли – 0,05-0,2 М. Растворитель добавляют медленно, чтобы избежать разогрева. Большинство белков осаждается при добавлении 20-50% растворителя (по объему). Следует отметить, что «процентное содержание» не совсем точный термин. Если к 50 мл ацетона добавить 50 мл воды, то общий объем жидкости составит только 95 мл. После уравновешивания смеси в течение 10-15 минут осадок отделяют центрифугированием. Затем осадок растворяют в холодном буфере. Обычно объем буфера в 2 раза превышает объем осадка. Небольшие количества органического растворителя (около 10% по объему) не мешают дальнейшему фракционированию.

Если температура при фракционировании органическими растворителями высока, происходит денатурация белка. Однако некоторые ферменты обладают высокой стабильностью, и денатурация носит избирательный характер.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием конц. р-ров минеральных и органических к-т, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60°С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствми – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных р-рах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в р-ре.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) уксусная к-та, 1% и 10% р-ры; 3) NaOH, 10% р-р.

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель р-ра яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом р-р мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства ( его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его р-р приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд ( один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд ( сохраняется один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю р-ра NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными к-тами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в р-ре (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной к-т выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной к-ты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная к-та.

Реактивы: 1) яичный белок,1% р-р; 2) конц. серная к-та; 3) конц. хлористоводородная к-та; 4) конц. азотная к-та.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной к-т. затем, наклонив пробирку под углом 45°, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной к-тами, в пробирке с азотной к-ой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими к-ами.

Трихлоруксусноая к-та осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой к-ой пользуются при определении белка в моче.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) трихлоруксусная к-та, 10% р-р; 3) сульфосалициловая к-та, 10% р-р.

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель р-ра белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой к-ты, а в другую – 5 капель трихлоруксусной к-ты. В пробирках выпадает осадок белка.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) сульфат меди, 10% р-р; 3) ацетат свинца, 5% р-р; 4) нитрат серебра, 5% р-р.

Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью – 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра – растворения осадка нет.

 

 

 

Комментирование закрыто.