инженер-химик.рф

Информационный портал для химиков


Разделение белков по коэффициенту седиментации

Мы уже видели, что центрифугирование является мощным и, как правило легко применимым способом отделения смеси компонентов клеток, но также полезны для разделения и анализа биомолекул. С помощью этой техники, мы можем определить такие параметры, как масса и плотность, узнать что-то о форме молекулы, и исследовать взаимодействие между молекулами. Для того, чтобы вывести эти свойства из данных центрифугирования, нам нужно математическое описание того, как частица ведет себя при центробежной силе.
Частица будет двигаться через жидкую среду при воздействии центробежной силы. Используем способ количественной оценки скорости движения, чтобы вычислить коэффициент седиментации, S, частицы с помощью следующего уравнения:

где т масса частицы, ν- является частичным удельным объемом (величина, обратная плотности частиц), ρ представляет собой плотность среды и F является коэффициентом трения (мера формы частицы). (1 — ρ) термин -выталкивающая сила, оказываемая жидкой средой.

Коэффициенты седиментации, как правило, выражается в единицах Сведберга , равных 10 -13 с. Чем меньше значение S , тем медленнее молекула движется в центробежном поле. Некоторые значения S  для клеточных компонентов приведены в таблице 4.2 и 4.14 .

Несколько важных выводов можно сделать из предыдущего уравнения:

1.

Скорость частицы зависит, в частности от ее массы. А еще массивные частицы оседаютя  быстрее, чем менее массивные частицы той же формы и плотности.

2.

Форма тоже влияет на скорость оседания, потому что это влияет на вязкое торможение. Коэффициент трения F компактной частицы меньше, чем у расширенной частицы той же массы. Следовательно, удлиненные частицы оседают медленнее, чем сферические той же массы.

3.

Плотная частица движется быстрее, чем это делает менее плотная, так как один минус выталкивающая сила (1 — ρ) меньше для более плотной частицы.

4.

Скорость осаждения также зависит от плотности раствора. (Ρ). Частицы  оседают когда ρ <1, плавают когда ρ> 1, и не двигаются, когда ρ = 1.

Метод, называемый зональными группами, или наиболее часто центрифугирование в градиенте, может быть использован для разделения белков с различными коэффициентами седиментации. Первым шагом является формирование градиента плотности в центрифужной пробирке. Различные пропорции раствора низкой плотности (такие, как 5% сахарозы) и раствор высокой плотности (например, 20% сахарозы) смешивают, чтобы создать линейный градиент сахарозы концентрацией от 20% в нижней части трубки до 5 % в верхней части ( рис.).  Небольшой объем раствора, содержащего смесь белков, для разделения помещается в верхнюю часть градиентной плотности. Когда ротор вращается, белки перемещаться по градиенту и делятся в соответствии с их коэффициентами седиментации. Время и скорость центрифугирования определяют эмпирически. Отделенные полосы или зоны белка могут быть собраны путем изготовления отверстия в нижней части трубы и сбора капель. Капли могут быть измерены на содержание белка и каталитической активности или другой функциональной особенности. Эта методика осаждения скоростей легко разделяет белки, отличающиеся по коэффициенту седиментации на значения два или более.

Рисунок 4.15. Зональный Центрифугирование.

Масса белка может быть непосредственно определена путем седиментационного равновесия, в котором образец центрифугировали при относительно низкой скорости, так чтобы осаждение уравновешивалось диффузии. Метод седиментации равновесия для определения массы является очень точным и может применяться в неденатурирующих условиях в которых сохранилась родная Четвертичная структура белков. В противоположность этому, электрофорез в SDS-полиакриламидном геле  дает оценку массы диссоциированных полипептидных цепей в денатурирующих условиях. Обратите внимание, что, если мы знаем массу диссоциированных компонентов мультимерного белка из SDS-полиакриламидного анализа и массу нетронутого мультимерного белка по осаждению, то мы можем определить, сколько копий каждой полипептидной цепи присутствует в мультимерноом белке.

Комментирование закрыто.