Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
Принцип использования гидрофобной хроматографии HIC
Белки в водном растворе имеют различные поверхностные группы и подвергаются воздействию растворителей в различной степени, в зависимости от структуры белка. Эти группы могут быть гидрофильными, содержащие полярные группы(Asp, Gly, Lis, His, Arg, Gly, Ser, Thr), или они могут быть гидрофобными, такие как в аминокислотах фенилаланин, тирозин и триптофан. Гидрофобные группы предпочитают спрятать себя внутри белковой 3D структуры но некоторые все равно остаются на поверхности. Соли могут быть использованы для осаждения или кристаллизации белков из раствора — вызвать у белков самоассоциацию. Ученые знали, что различные соли играют важную роль в самоассоциации или ассоциацию с гидрофобными поверхностями. Рисунок 1 показывает небольшой выбор солей, используемых в хроматографии, которые модулируют гидрофобное взаимодействие. Соли указаны справа налево в порядке возрастания «высаливания». Эти явления формируют основу для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). Хроматографические матрицы, содержащие гидрофобные группы, связывают белки из водных растворов в различной степени в зависимости от белковых структур и ряда управляемых факторов, включая концентрацию солей, рН, температуру и органические растворители (рис.2).
Гидрофобная хроматография подходит для всех этапов процесса очистки. Примеры применения включают захват высокомолекулярных, очистка моноклональных антител, удаление укороченных видов из полнометражных форм, отделяя активные от неактивных форм и очистка вирусов. HIC образует один из ортогональных методов в классическом подходе к очистки биомолекул зарядом, гидрофобностью и размером в 3 шага протокола. Он дополняет смежные стадии очистки в том, что подвижная фаза, используемая для связывания или элюции белка схожа с теми, в которые необходимы в предшествующих или последующих хроматографиях. Так белки наносятся при высоких и элюируются при низких концентрациях соли, гидрофобная хроматография идеально подходит для использования после ионного обмена или осаждения солью, как показано на рисунке 3
Как правило, образец наносится в высокой концентрации соли и элюировали с градиентом вплоть до буфернго низкого содержания соли. Добавки, такие как этанол, этиленгликоль или аминокислот могут быть добавлены, чтобы повысить производительность в различных способах. В условиях захвата белка, где основной целью является, очистка и концентрирование молекулы-мишени, чаще всего является предпочтительным ступенчатый градиент для элюирования, а не линейный градиент. HIC широко используется в промышленных процессах.
Проблемы в гидрофобной хроматографии
Хотя HIC мощная техника очистки, удачный выбор HIC сред и условий для их использования может быть сложной задачей. В то время как разделение в гель-фильтрации и ионного обмена являются относительно простыми для прогнозирования и модулирования, гидрофобная хроматография является более сложным методом. Опыт показывает, что связывание со смолой трудно прогнозировать. Также оптимальные условия элюции могут зависеть от многих факторов. Иногда выход материала неожиданно низкий из-за неблагоприятных условий, растворителей или денатурации белка-мишени на гидрофобной поверхности. Диапазон добавок, которые могут быть использованы для повышения производительности также усложняет выбор. Сегодня, компания GE Healthcare предлагает широкий спектр HIC смол, охватывающий от сильных к слабым гидрофобным взаимодействиям, на различных матрицах и с диапазоном размеров гранул, чтобы соответствовать большинству работ. Это приводит к большей вероятности достижения успеха в лабораторных условиях и более быстрому пути к оптимизации метода.
Подбор условий для гидрофобной хроматографии
Для достижения полного разделения потенциал HIC в диапазоне применений требует широкий спектр смол с различной гидрофобностью и эксплуатационными свойствами. Это достигается путем варьирования базовых матриц и химической природой лигандов.
На рисунке 9 показаны результаты исследования элюции из шести модельных белков в двумерной матрице. Средний объем удерживания (выраженное в объемах колонки, CV) рассчитывали как меру относительной гидрофобности каждой среды (ось х). Для отображения разрешающей способности, (Y-ось).Среднее разрешение, естественно, определяет размер частиц, но разница в селективности для специфических белков также играет определенную роль. Особенно обратите внимание на улучшенную производительность последнего поколения Capto смолы.
Комментирование закрыто.