инженер-химик.рф

Информационный портал для химиков


Конъюгаты антигенов и антител с пероксидазой хрена

Пероксидаза хрена или HRP (Horseradish peroxidase) выделяется из корневищ хрена Armoracia rusticana и является гликопротеином с молекулярной массой около 40 кДа. Содержит в качестве кофакторов гем и два иона кальция. Фермент пероксидаза катализирует реакцию, протекающую по схеме:

субстрат + H2O2 = окисленный субстрат + 2 H2O

Метод конъюгирования основан на использовании полисахаридных цепей фермента для конъюгирования с антителами. Мягкое окисление остатков сахаров периодатом натрия создает активные альдегидные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами иммуноглобулинов с образованием онований Шиффа. Восстановление полученных оснований Шиффа приводит к формированию стабильных высокомолекулярных конъюгатов (см. схему ниже).

Схема реакции конъюгирования антител с пероксидазой хрена

Конъюгаты антител с пероксидазой стабильны и могут храниться при +4oС. Обязательным условием при этом является наличие в растворе бактериостатических компонентов, препятствующих развитию микроорганизмов и протеолитической деградации белкового конъюгата. Для длительного хранения конъюгатов при температуре −20oС в качестве криопротектора может использоваться глицерин (содержание в растворе — 50%).

Наиболее широко используемый в биохимии бактериостатик азид натрия является ингибитором пероксидазы и не может быть использован при хранении растворов этого белка. В случае, если планируется хранить растворы конъюгата при +4 oС долгое время, используют 0,05% раствор органического бактериостатика ProСlin 300 (Sigma-Aldrich).
Применение: Фермент используется для конъюгирования (соединения с другими веществами) в целях усиления слабого сигнала нужных белков и молекул и их более точной идентификации. Готовые конъюгаты применяются в анализах различного типа: вестерн-блоттинге, иммуноферментных, иммуногистохимических, к примеру, для иммуноферментного определения антител к тиреоидной пероксидазе.

Протокол:

I. Подготовка антител.
Для успешной конъюгации пероксидазы с антителами, последние необходимо перевести в 0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 9,5. Для этой цели можно использовать колонки на основе Сефадекса-25 для смены буфера фирмы GE Healthcare (NAP-5, NAP-10, PD-10) или диализ.

II. Активация пероксидазы.
1. Навеску 2 мг пероксидазы растворить в 0,4 мл бидистиллированной воды.
2. Приготовить раствор 0,1 М периодата натрия в бидистиллированной воде и сразу же добавить 0,1 мл этого раствора к раствору пероксидазы. Быстро перемешать, обернуть пробирку с реакционной смесью фольгой (реакция должна проводиться в темноте) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Признаком образования активной формы пероксидазы служит изменение окраски раствора фермента с желто-коричневой на зеленоватую. При длительном хранении на свету активированная форма быстро переходит в неактивную, при этом зеленая окраска снова переходит в коричневую. Поэтому все последующие стадии должны осуществляться по возможности быстро.
3. Активированную пероксидазу перевести в буфер пришивки (1 мМ ацетат натрия рН 4,4 на колонке), используя колонку для смены буфера.

III. Конъюгирование антител с пероксидазой.
Оптимальное массовое соотношение количества антител к количеству пероксидазы 2:1, т.е. на 2 мг активированной пероксидазы необходимо взять 1 мг антител. Раствор антител к пероксидазе (активированной) добавляется в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 9,5. Инкубацию реакционной смеси проводить при перемешивании на шейкере в течение 40 минут при +37oС в пробирке, обернутой фольгой.

IV. Восстановление не прореагировавших альдегидных групп пероксидазы боргидридом натрия.
Приготовить свежий раствор борогидрида натрия, растворив 2 мг в 0,5 мл бидистиллированной воды. Добавить 0,1 мл полученного раствора к реакционной смеси и инкубировать 20 мин при +37oС.

V. Перевод конъюгата в буфер хранения.
Конъюгат антител с пероксидазой перевести в буфер хранения (PBS) на соответствующей колонке для смены буфера или методом диализа, добавить ProClean до конечной концентрации 0,05% и тщательно перемешать. Конъюгат хранить при +4oС. Обратите внимание: возможно хранение конъюгатов при −20°С в присутствии 50% глицерина.

VI. Тестирование полученного конъюгата.
Тестирование проводится с использованием метода прямого иммуноферментного анализа путем раститровки полученного конъюгата по антигену.

Также отметим, что в ассортименте продукции Биалекса есть моноклональные АТ к пероксидазе хрена, с помощью которых можно детектировать сам фермент HRP при иммуногистохимических и иммуноферментных анализах.

Комментирование закрыто.